Ученые разработали новый метод получения стволовых клеток

Аденовирусы — возбудители многих болезней, в том числе и СПИДа, могут оказаться серьезными помощниками в изучении стволовых клеток. Фото с сайта www.mapposity.com
Аденовирусы — возбудители банального ОРЗ — могут оказаться серьезными помощниками в изучении стволовых клеток. Модель с сайта www.mapposity.com

Американские ученые разработали новый метод получения стволовых клеток, который предполагает преобразование соматической клетки в стволовую с помощью аденовирусов. Специально подготовленные аденовирусы привносят в соматическую клетку необходимый набор эмбриональных генов, которые и запускают процесс омоложения клетки. В отличие от прежних, новая технология не изменяет геном исходной клетки и не вызывает появления опухолей.

В области исследования стволовых клеток серьезные усилия ученых направлены на поиск действенных технологий перепрограммирования соматических клеток в плюрипотентные, то есть способные к различной специализации. В течение последних двух-трех лет были определены гены, которые работают в стволовых клетках и определяют экспрессию генома на самых ранних стадиях развития эмбриона. Это гены транскрипционных факторов Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc и Nanog и некоторые другие. Если ввести их в соматическую клетку, например в фибробласт, то клетка перерождается и приобретает свойства плюрипотентности. Каким образом можно доставить эти гены в клетку, и не просто доставить, а еще и заставить их там работать?

Сейчас эксплуатируется вирусная и липосомная передача генов. Липосомы с заключенными внутри генами «плюрипотентности» внедряются в клетку, но эффективность встраивания и активации трансгенного материала чрезвычайно низка. Более эффективно использование вирусного носителя или вирусного вектора (см. схему).

Схема доставки генов в клетку методом вирусного вектора. Рис. с сайта moikompas.ru
Схема доставки генов в клетку методом вирусного вектора (см. пояснения в тексте). Рис. с сайта moikompas.ru

Обезвреженные РНК-вирусы (ретровирусы), содержащие требуемые гены вместе с генами ревертазы и некоторыми другими (на схеме — 1), направляются к клетке. После того как клетка с помощью рецепторов опознает вирусную оболочку (2), вирус внедряет в клетку РНК (3). В клетке РНК с помощью ревертазы (обратной транскриптазы) переписывается в ДНК (4) и проникает в ядро соматической клетки (5). Там синтезированная чужеродная ДНК, несущая нужные гены и некоторые вирусные гены, встраивается в ДНК самой клетки (6). После чего всё идет своим чередом: клетка при делении синтезирует копии обновленного генома, синтезирует мРНК (7), необходимые терапевтические белки (8), ради которых и была затеяна эта сложная процедура. РНК вируса одеваются вирусной оболочкой и выходят из клетки, заражая новые поколения клеток (10).

Если встраивание чужеродной ДНК произошло в безопасном месте, то соматическая клетка «молодеет», перерождается в стволовую, или, точнее, происходит процесс индукции плюрипотентных клеток. Однако зачастую гены внесенных транскрипционных факторов встраиваются неудачно, и тогда соматическая клетка превращается в опухолевую. Кроме того, эта технология в принципе подходит только для активно делящихся клеток. Для внедрения генного материала в неделящуюся клетку применяют аденовирусный вектор.

Аденовирусный вектор — это вирион с двухцепочечной ДНК, хорошо знакомый нам по назойливым простудным заболеваниям. Аденовирусы не способны встраиваться в геном клетки-хозяина, поэтому экспрессия внедренных генов только временная. Последнее свойство со всей очевидностью ограничивает использование аденовирусных векторов для терапевтических целей, так как достигается только временный лечебный эффект, но для ограниченного во времени процесса преобразования соматической клетки в стволовую этот метод подходит как нельзя лучше. Здесь важно только запустить процесс индукции.

Несмотря на известную теоретическую допустимость данной технологии, ее практическое осуществление документировано только сейчас. Эту технологию отработала группа специалистов из нескольких медицинских исследовательских центров штата Массачусетс (США) под руководством Конрада Хохедлингера (Konrad Hochedlinger) из Гарвардского института стволовых клеток. Попытки были предприняты и раньше, но они не увенчались успехом. Неудача объяснялась, по-видимому, быстрым растворением аденовирусов в соматических клетках.

На этот раз исследователи применили новую методику, разработанную группой в последнее время. В ней используется линия мышей с геном Oct4, транскрипция которого активируется антибиотиком доксициклином. Поэтому в первой серии экспериментов ученые ставили опыты с клетками именно этой линии мышей. В качестве «подопытных» соматических клеток были выбраны мышиные эмбриональные клетки печени, фибробласты и взрослые гепатоциты; клетки обрабатывались доксициклином параллельно с вирусным заражением. В результате начиналась экспрессия гена Oct4, которая запускала целый каскад реакций. Опыт продолжался около месяца. За это время все типы клеток показали способность к перепрограммированию, дав по нескольку колоний индуцированных плюрипотентных клеток. В этих колониях синтезировались свои собственные, уже не вирусные эмбриональные гены.

Экспрессия собственных (эндогенных) эмбриональных генов в колониях полученных в результате опыта индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток эмбриональной печени (FL), фибробластов (TTF), взрослых гепатоцитов (HEP). Для сравнения показан уровень экспрессии этих генов в эмбриональных стволовых клетках (ES). Как мы видим, уровень экспрессии этих транскрипционных факторов во всех случая примерно одинаковый. Рис. из обсуждаемой статьи в Science
Экспрессия собственных (эндогенных) эмбриональных генов в колониях полученных в результате опыта индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток эмбриональной печени (FL), фибробластов (TTF), взрослых гепатоцитов (HEP). Для сравнения показан уровень экспрессии этих генов в эмбриональных стволовых клетках (ES). Как мы видим, уровень экспрессии этих транскрипционных факторов во всех случая примерно одинаковый. Рис. из обсуждаемой статьи в Science

Важно было показать, что аденовирусное перерождение клеток возможно и в линиях нормальных мышей, без доксициклин-зависимого аллеля Oct4. Такой эксперимент был поставлен на клетках взрослых гепатоцитов. Эти клетки больше других подвержены заражению аденовирусом. Через месяц инкубации были выделены колонии клеток, в которых нормально работали требуемые эмбриональные гены. Превращение взрослых гепатоцитов в стволовые клетки происходило за счет деметилирования необходимых эмбриональных генов. У зрелых соматических клеток эмбриональные гены, напротив, гиперметилированы и поэтому не работают.

Ученые отмечают очень низкую эффективность аденовирусного перепрограммирования клеток: при ретровирусном переносе 0,01–0,1%, а при аденовирусном — 0,0001–0,001%. Зато у этого метода есть несколько важнейших преимуществ. Первое из них — ни в одном случае не появилось опухолевых образований, а при ретровирусном переносе клетки очень часто порождают опухоли. Второе — геном получившейся плюрипотентной клетки не имеет вирусных вставок и потому идентичен геному эмбриональной клетки; это делает возможным полное сравнение работы обоих геномов. Оба преимущества предполагают широкие возможности для будущих терапевтических разработок. Поэтому в последних строках своего сообщения авторы выразили надежду, что данная работа продолжится, но с использованием человеческих соматических клеток.

Источник: Matthias Stadtfeld, Masaki Nagaya, Jochen Utikal, Gordon Weir, Konrad Hochedlinger. Induced Pluripotent Stem Cells Generated Without Viral Integration // Science. V. 322. P. 945–949 (7 November 2008). DOI: 10.1126/science.1162494.

См. также:
Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки — очень полезный популярный обзор по теме (с картинками).

Елена Наймарк


16
Показать комментарии (16)
Свернуть комментарии (16)

  • eager_chromatin  | 11.11.2008 | 19:57 Ответить
    Про подпись к первому рисунку: "Аденовирусы - возбудители многих болезней, в том числе и СПИДа...". Исправьте, пожалуйста! А за статью спасибо, метод интересный (и давно ожидаемый).
    Ответить
    • -claim- > eager_chromatin | 11.11.2008 | 20:01 Ответить
      Меня тоже смущает смешение ретро- и аденовирусов. Если идет речь про ВИЧ, и нет какого-то особого мнения про иммунодефицит, то подпись некорректна.
      Ответить
      • eager_chromatin > -claim- | 11.11.2008 | 20:47 Ответить
        И к тому же подпись бросается в глаза. А метод ОЧЕНЬ интересный. Кстати, вспомнила, как некоторое время назад было спорное упоминание об участии одного из аденовирусов в трансформации стволовых клеток в жировые. Так что еще копать и копать:-)
        Ответить
    • editor > eager_chromatin | 11.11.2008 | 20:54 Ответить
      Спасибо, исправили.
      Ответить
  • Maksimov  | 13.11.2008 | 05:17 Ответить
    Это, конечно, хорошо. Но главное не получить стволовые клетки, а заставить дифференцироваться их в нужный нам тип клеток, а это как раз очень трудно и сейчас пока плохо получается. Даже если клетки и демонстрируют необходимые маркеры при иммуногистохимическом исследовании, это ещё не значит, что они встроятся в ткань и будут нормально выполнять свою функцию.
    Ответить
    • celltranspl.ru > Maksimov | 14.11.2008 | 20:51 Ответить
      Про дифференцировку не согласен с Вами - работ по дифференцировке ЭСК во все что угодно в настоящий момент уже полно.. основная задача - это получение иммуносовместимых плюрипотентных клеток для каждого потенциального пациента - а с этим действительно, проблемы.. iPS-клетки в данном случае как раз и могут помочь, но только если будут разработаны безопасные методы их получения.

      Про будут или не будут встраиваться - согласен вопрос мутный.. однако всяких вселяющих надежд экспериментов тоже хватает..
      Ответить
  • glagol  | 13.11.2008 | 22:47 Ответить
    Да, просто поразительно, как быстро удалось решить многие задачи, которые еще недавно казались неразрешимыми. В соседней статье описаны сходные результаты, полученные при использовании в качестве вектора плазмид.

    Несколько замечаний в порядке уточнения:
    "Неудача объяснялась, по-видимому, быстрым растворением аденовирусов в соматических клетках." Наверное, речь идет о расщеплении ферментами молекул этих аденовирусов?
    "В этих колониях синтезировались свои собственные, уже не вирусные эмбриональные гены." Эти гены там, конечно, не синтезировались, а экспрессировались.
    Существенно (для специалистов), что с помощью вирусов вводили в клетки первой линии три гена из упомянутых (Sox2, Klf4, c-Myc), а в клетки второй линии - четыре (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc). Что касается последующей дифференцировки, то, насколько я понял, критерием способности к ней считается образование тератом при введении эмбриональных стволовых клеток в организм безтимусным мышам. В данном случае тератомы (опухоли из клеток разных дифференцированных тканей) успешно формировались. Что касается обычных стволовых клеток, в некоторых случаях они явно дифференцируются неплохо (например, удалось получить из них работающие островки из бета-клеток в поджелудочных железах мышей - Science 18 May 2001:Vol. 292. no. 5520, pp. 1389 - 1394. Может, скоро и у человека научатся лечить диабет первого типа?
    Ответить
    • celltranspl.ru > glagol | 14.11.2008 | 20:58 Ответить
      Про критерии дифференцировки - формирование тератом при трансплантации иммунодефицитным животным - это лишь один из критериев, причем далеко не самый строгий. Лучший из всех - это введение клеток-"претендентов" в полость бластоцист, состоящих из тетраплойдных клеток..
      Ответить
  • celltranspl.ru  | 14.11.2008 | 20:46 Ответить
    Версия новости на celltranspl.ru - http://www.celltranspl.ru/news/newspost31

    Что касается работы Конрада, то на мой взгляд она менее значительна, чем работа Шиньи с плазмидами и вот почему:
    - http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/321/5892/1084?sa_campaign=Email/toc/22-August-2008/10.1126/science.1155544
    - http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/321/5892/1086?sa_campaign=Email/toc/22-August-2008/10.1126/science.1155546
    Аденовирусы непосредственно сами могут вызывать эпигенетическое перепрограммирование, которое может приводить к опухолевой трансформации клеток и, следовательно, в плане практического применения исследование ничего не дало. Кроме того, опять же, если аденовирусы могут вызывать эпигенетические изменения - нельзя уверенно утверждать, что iPS-клетки получились только лишь благодаря эктопической экспрессии экзогенных факторов..
    Ответить
  • Maksimov  | 15.11.2008 | 04:42 Ответить
    Эта работа примечательна ещё и тем, что подтвердила надёжность Oct-4 как маркера для идентификации стволовых клеток, другие часто используемые маркеры, такие как, например, c-kit,sca-1 не являются типичными только для стволовых клеток. Однако, дело в том, что клетки имеющие Oct-4 встречаются и во взрослом организме, в том числе и у человека, в том числе и в поджелудочной железе (например Zhao M., Amiel A. et al. Evidence for the presence of stem cell-like progenitor cells in human adult pancreas Journal of Endocrinology (2007) 195, 407-414. Почему же тогда не происходит полноценного восстановления многих тканей и органов? Здесь дело может быть вот в чём. Мы видим людей с патологией: диабетом, инфарктом, инсультом и т.д, но не видим норму т.е. людей организм которых функционирует так, что у них эти болезни не возникают. Один пример известный многим патологоанатомам: причина смерти - не болезнь сердца, при жизни - ни одной жалобы на сердце, а на вскрытии массивный атеросклероз коронарных артерий. Прчина этого может быть хорошая регенерационная способность организма. Т.е. болеют люди у которых плохая регенерация т.е. либо дефект стволовых клеток либо неспособность их дифференцироваться и интегрироваться в ткань. Поэтому если взять клетки такого человека и раздифференцировать их как предложено в методике, а затем ввести в организм, то никакой регенерации может и не быть. И вообще, сейчас уже в каждом органе в т.ч. в сердце и мозге найдены резидентные стволовые клетки, но тем не менее органы полноценно не регенерируют. Лев Владимирович Полежаев впервые блестяще доказал возможность стимуляции регенерации миокарда, но в его опытах примерно через год новообразованные кардиомиоциты вытеснялись соединительной тканью. Не произойдёт ли это и с введёнными стволовыми клетками? Я просто хочу показать, что проблема регенерации не сводится только к получению стволовых клеток и введению их в очаг поражения. Самое главное как поведут они себя во взрослом, высоко дифференцированном организме и как заставить введённые клетки дифференцироваться в нужную ткань, а то, например, в мозгу могут появиться гепатоциты. Именно по этой причине введение клеток в бластоцисту и отслеживание их судьбы не очень подходит для регенерационной медицины.
    Ответить
    • TestPilot > Maksimov | 15.11.2008 | 06:03 Ответить
      Ну, регенерации как таковой просто от введения стволовых клеток ждать не следует. Надежды как я понимаю связаны больше с размножением и дифференцированием клеток вне организма и последующей массовой доставкой их в поврежденную область.

      И не забывайте, что организм постоянно обновляется. Так например клетки кожи человека полностью заменяются в течении полутора месяцев(или около того, вспомните как сходит загар). За год человек меняет клеток по массе сопоставимое количество с собственно массой индивидуума. Но это отнюдь не значит, что человек молодеет - как раз наоборот.

      Ну и писать, что "соматическая клетка <<молодеет>>" некорректно. Хотя аналогия с эмбриональными клетками и ясна. Старые стволовые клетки отличается от молодых. A то иначе у нас бы была вечномолодая кожа :)
      Ответить
      • Maksimov > TestPilot | 15.11.2008 | 07:36 Ответить
        Я и не писал, что соматическая клетка молодеет. Я имею ввиду, что в организме взрослого человека есть свои стволовые клетки (часть из них имеет тот самый Oct-4 и другие маркеры стволовых клеток)в каждом органе и ткани, они называются резидентными, не путать с эмбриональными. :-)Но почему-то они не обеспечивают адекватной регенерации при повреждении некоторых органов (мозг, сердце, клетки кортиева органа, подоциты и т.д.), или обеспечивают её, но не у всех людей, такие личности не попадают к врачам, так как у них всё нормально и ретроспективно отследить их крайне трудно.
        Собственно опыты Полежаева это и показали: сердце само по себе не регенерирует, но если его стимулировать, то новые кардиомиоциты появляются не путём деления старых, а из недифференцированных клеток. Современные данные это подтвердили. Массивная пересадка дифференцированных клеток полученных из ЭСК в настоящее время не спасает ситуацию полностью, а только улучшает её на время. Свежий пример: Cao F, Wagner RA Transcriptional and functional profiling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes.PLoS ONE. 2008;3(10):e3474. Поэтому даже если и пересадим дифференцированные клетки, ещё не значит, что они выживут, надо будет их поддерживать уже в организме, чтобы они не померли и встроились в ткань, интенсивные работы в этом напрвлении тоже ведутся, например, Rota M et al. Local activation or implantation of cardiac progenitor cells rescues scarred infarcted myocardium improving cardiac function.Circ Res. 2008 Jul 3;103(1):107-16
        Ну и потом, не все клетки нашего организма обновляются, некоторые рождаются и умирают с нами, а если погибнут раньше нас, то не восстанавливаются (например, подоциты, клетки кортиева органа, именно поэтому человек постепенно утрачивает способность различать некоторые частоты с возрастом, и т.д., по некоторым клеткам данные спорные-кардиомиоциты, нейроны коры головного мозга). :-)
        Ответить
        • TestPilot > Maksimov | 15.11.2008 | 10:37 Ответить
          "если взять клетки такого человека и раздифференцировать их как предложено в методике, а затем ввести в организм, то никакой регенерации может и не быть" - вы писали? Так вот, конечно-же в этом случае никакой регенерации не будет! Уже сотни раз проверено на мышах. ПСК и ЭСК. Если и есть ХОТЬ КАКОЙ-НИБУДЬ смысл - то размножать и вводить дифференцированные клетки. И да, даже с дифференцированными клетками перспективы пока туманные. Потому как их даже толком дифференцировать не умеем, не то что создавать ткани. А еще нужен межклеточный матрикс, кровеносные сосуды, форма ткани, ее плотность и так далее вагон и тележка проблем. И чудес ждать тут в ближайшем будущем не следует. Даже если предложенная в статье методика получения iPS окажется эффективной, безопасной и дешевой.

          А по поводу регенерации, здесь например была статья про исследование регенерации крыла цыпленка: http://elementy.ru/news/430394 В плане понимания, там даже кот рядом не валялся. Не говоря уже про реальное применение регенерации.

          PS. Ну то есть в целом с вами согласен.
          Ответить
      • Огы > TestPilot | 18.11.2008 | 16:29 Ответить
        "Так например клетки кожи человека полностью заменяются в течении полутора месяцев(или около того, вспомните как сходит загар)." - А если у меня, например, спустя 10 месяцев видна разница между загорелой частью и не загорелой. Или проще говоря, загорал я последний раз 10 месяцев назад, а загар держится. Это что значит что у меня клетки не делятся :)
        Ответить
    • celltranspl.ru > Maksimov | 15.11.2008 | 22:33 Ответить
      "Эта работа примечательна ещё и тем, что подтвердила надёжность Oct-4 как маркера для идентификации стволовых клеток, другие часто используемые маркеры, такие как, например, c-kit,sca-1 не являются типичными только для стволовых клеток."
      По-моему, вы переоцениваете роль Oct-4 - ничего подобного в работе подтверждено не было...
      Ответить
  • rusher7777  | 18.12.2008 | 12:48 Ответить
    Меня лично интересует только цена вопроса...
    Скок будет стоить десяток миллионов моих стволовых.
    Это вторая половинка билета в вечность, первая у меня уже есть и бесплатно...
    Ответить
Написать комментарий

Другие новости


Элементы

© 2005-2017 «Элементы»