Мутагенез в лимфоцитах — результат целенаправленного изменения ДНК и последующей «неточной починки»

Лимфоциты — белые кровяные клетки, играющие ключевую роль в формировании приобретенного иммунитета (фото с сайта www.merck.com; © Robert Becker/Custom Medical Stock Photo)
Лимфоциты — белые кровяные клетки, играющие ключевую роль в формировании приобретенного иммунитета (фото с сайта www.merck.com; © Robert Becker/Custom Medical Stock Photo)

Лимфоциты млекопитающих производят огромное количество разнообразных антител — защитных белков, избирательно связывающихся со всевозможными чужеродными молекулами (антигенами). Способность вырабатывать иммунитет к новым инфекциям основана на внесении в гены антител случайных изменений — мутаций и последующем размножении тех лимфоцитов, у которых мутации оказались наиболее удачными. В опытах с трансгенными мышами американские ученые показали, что мутирование генов антител начинается с целенаправленной замены цитозинов урацилами, после чего в результате неточной починки (репарации ДНК) мутации распространяются в обе стороны от каждого урацила на расстояние до 30 нуклеотидов.

B-лимфоциты человека и других млекопитающих способны синтезировать миллионы разнообразных антител. Как и все прочие белки, антитела синтезируются на основе «инструкций», записанных в генах. Однако число генов в геноме млекопитающих на много порядков меньше, чем число типов антител, производимых организмом в течение жизни. Организм не может запастись заранее всеми необходимыми генами антител по двум причинам: во-первых, такое количество генов не поместится ни в каком геноме (это привело бы к непомерному росту «расходов» на содержание в каждой клетке громадного количества ДНК), во-вторых, как бы ни был велик запас защитных генов, в любой момент может появиться новая инфекция, для борьбы с которой не подойдет ни одно из имеющихся антител.

Позвоночные животные решили эту проблему, выработав специальные механизмы для прижизненного редактирования своего генома. В частности, гены антител формируются в геноме B-лимфоцитов по мере необходимости из специальных «заготовок» (гены антител в норме не передаются по наследству — наследуются только «заготовки»). Этот творческий процесс основан на тех же принципах, что и биологическая эволюция, — на случайных мутациях и избирательном размножении удачных вариантов. Впрочем, в обоих случаях «случайность» мутаций — понятие весьма относительное. Оно означает лишь, что клетка не может знать заранее, к какому результату приведет та или иная конкретная мутация. Однако клетка вполне способна контролировать скорость мутагенеза и его приуроченность к тем или иным участкам генома. Редактирование генома, таким образом, осуществляется по принципу «оптимизированного случайного поиска».

Формирование генов антител в геноме B-лимфоцитов происходит в два этапа. Сначала, на ранних стадиях развития организма, гены антител формируются комбинаторным путем из унаследованного от родителей набора заготовок (подробнее см. здесь). Каждый B-лимфоцит продуцирует только один тип антител. На этом этапе неизбежно возникают «неудачные» лимфоциты, опасные для организма: они производят антитела, атакующие собственные антигены (молекулы) организма. Такие лимфоциты выбраковываются, остальные сохраняются и размножаются. В результате животное получает большой набор B-лимфоцитов (и, соответственно, антител), способных атаковать почти любые молекулы, кроме тех, которые в норме присутствуют в данном организме.

Когда в организм попадает инфекция, гены антител подвергаются более тонкой «настройке». Те лимфоциты из имеющегося набора, чьи антитела проявляют наибольшее сродство к новому чужеродному антигену, начинают вносить случайные изменения в гены своих антител (точнее, в определенные участки этих генов — так называемые вариабельные области, или V-области). Этот процесс называется соматическим гипермутированием. Получающиеся новые варианты генов экспрессируются (то есть на их основе синтезируются антитела) и проверяются на эффективность, то есть на степень сродства к новому антигену. Это продолжается до тех пор, пока не будет найден высокоэффективный вариант гена, обеспечивающий надежную защиту от нового возбудителя. Лимфоциты, производящие такое антитело, начинают усиленно размножаться. После выздоровления некоторые из них могут долго сохраняться в качестве клеток «иммунной памяти», что снижает риск повторного заболевания.

Схема строения антитела. Антитело состоит из четырех белковых молекул — двух больших, или «тяжелых» цепей и двух маленьких («легких»). Вариабельная область отвечает за связывание антигена, именно в нее вносятся изменения при соматическом гипермутировании. Рис. с сайта www.jdaross.cwc.net
Схема строения антитела. Антитело состоит из четырех белковых молекул — двух больших, или «тяжелых» цепей и двух маленьких («легких»). Вариабельная область отвечает за связывание антигена, именно в нее вносятся изменения при соматическом гипермутировании. Рис. с сайта www.jdaross.cwc.net

Соматическое гипермутирование — процесс во многом загадочный. До сих пор о его механизмах было известно немногое. Было установлено, что в нём участвует особый фермент — цитидин-дезаминаза, индуцируемая активацией (activation induced (cytidine) deaminase, AID). Этот фермент атакует нуклеотиды Ц (цитозины) в V-области и отрывает от них аминогруппу (–NH2), превращая их тем самым в урацилы (У). После этого в окрестностях урацилов начинают появляться мутации (замены нуклеотидов). Мутагенез осуществляется при помощи систем репарации (починки) и репликации (удвоения, размножения) ДНК, которые в данном случае работают с большим количеством «ошибок». Многое оставалось неясным: в частности, было неизвестно, насколько необходимым является дезаминирование цитозинов для инициации гипермутирования; зависит ли число и характер мутаций от того, какой именно из цитозинов будет дезаминирован; распространяются ли мутации в обе стороны от дезаминированного цитозина или только в одну и т. д.

Чтобы прояснить детали этого процесса, биологи из Йельского университета (США) создали трансгенных мышей, которым в V-области генов антител были вставлены искусственно синтезированные фрагменты ДНК длиной в 100 нуклеотидов. Всего было использовано 4 таких фрагмента, каждый из которых вставлялся в геном одной из линий трансгенных мышей. В двух случаях из четырех фрагмент состоял только из нуклеотидов А и Т. В двух других в нём имелся один нуклеотид Ц и, соответственно, комплементарный ему нуклеотид Г в противоположной (комплементарной) цепи двухцепочечной молекулы ДНК. Фрагменты были вставлены таким образом, что у одних мышей ключевой нуклеотид Ц оказался в «нижней» (кодирующей) цепи ДНК, на основании которой синтезируется белок, а у других — в «верхней» (некодирующей).

Из B-лимфоцитов взрослых мышей выделяли ДНК и смотрели, какие мутации и в каком количестве появились во внедренном фрагменте. Оказалось, что если фрагмент не содержал нуклеотида Ц, то мутации в нём возникали лишь по краям — там, где расстояние до ближайшего Ц (расположенного за пределами внедренного фрагмента) не превышало 30 нуклеотидов. В центральной части вставленного участка ДНК мутации отсутствовали вовсе. Это означает, что присутствие цитозинов абсолютно необходимо для запуска процесса гипермутирования, и мутации распространяются лишь на небольшое расстояние от каждого Ц.

Если в середине фрагмента был нуклеотид Ц, расположенный в «верхней», некодирующей цепи ДНК, то мутации возникали в большом количестве по всей длине фрагмента. Однако если нуклеотид Ц оказывался в «нижней», кодирующей цепи, а в «верхней» напротив него располагался комплементарный ему нуклеотид Г, мутации не происходили (или заменялась только сама пара ГЦ, а окружающие ее нуклеотиды А и Т все оставались на своих местах). Таким образом, выяснилось, что сигналом для запуска процесса гипермутирования может служить только нуклеотид Ц, расположенный в «верхней» цепи ДНК. Может быть, это объясняется тем, что фермент AID каким-то образом отличает верхнюю цепь от нижней и дезаминирует цитозины только в верхней цепи? Авторам удалось показать, что это не так, что цитозины обеих цепей подвергаются дезаминированию в равной степени. Однако в нижней цепи это приводит к замене другим нуклеотидом только самого цитозина, а в верхней — также и к замене многих соседних нуклеотидов.

Особенно часто мутации происходят на расстоянии в 4–15 нуклеотидов по обе стороны от дезаминированного цитозина в верхней цепи. По мнению авторов, ключевую роль здесь играет система репарации (починки) ДНК. Белки, осуществляющие репарацию, находят в верхней цепи дезаминированный цитозин (урацил) и начинают «исправлять ошибку». Вероятно, они при этом вырезают довольно большой кусок ДНК вокруг «испорченного» нуклеотида, а потом не слишком аккуратно его восстанавливают. Так и появляются многочисленные мутации. По-видимому, за починку верхней и нижней цепи отвечают разные системы репарации, причем первые работают с ошибками, а вторые — без. При помощи ряда дополнительных экспериментов ученым удалось выявить конкретные белки, ответственные за «неаккуратную починку» верхней цепи ДНК в V-областях (Msh2/6, Exo1, ДНК-полимераза η).

Данное исследование — важный шаг к пониманию того, каким образом живая клетка может контролировать изменения собственного генома. Однако вопросов по-прежнему остается много. Например, очень хотелось бы узнать, каким образом фермент AID находит V-область и как клетка определяет, к каким из «испорченных» нуклеотидов нужно направить точные, а к каким — склонные к ошибкам системы репарации. Наконец, эволюционистов-теоретиков не может не волновать крамольный вопрос: что если механизм гипермутирования иногда включается не только в лимфоцитах?

Источник: Shyam Unniraman, David G. Schatz. Strand-Biased Spreading of Mutations During Somatic Hypermutation // Science. 2007. V. 317. P. 1227–1230.

См. также:
1) Э. Стил, Р. Линдли, Р. Бландэн. Что, если Ламарк прав? Иммуногенетика и эволюция.. В этой книге дано хорошее популярное изложение основных принципов формирования приобретенного иммунитета, в том числе подробно рассматривается формирование генов антител и соматическое гипермутирование. Следует отметить, что предложенная авторами гипотеза о природе молекулярных механизмов гипермутирования не подтвердилась (авторы полагали, что этот механизм основан на обратной транскрипции).
2) Гонококки обманывают иммунную систему, внося контролируемые изменения в свой геном, «Элементы», 31.05.2006.
3) Раскрыта тайна иммунной системы насекомых, «Элементы», 27.06.2006.
4) Рассеянный склероз: роковая ошибка иммунной системы, «Элементы», 17.01.2006.

Александр Марков


5
Показать комментарии (5)
Свернуть комментарии (5)

  • Vagant  | 04.09.2007 | 10:50 Ответить
    Наконец, эволюционистов-теоретиков не может не волновать крамольный вопрос: что если механизм гипермутирования иногда включается не только в лимфоцитах?

    Вот, уже теплее!! Я бы добавил, - а также и в некодирующей (негенной, некчемной) области хромосомы У, например.
    Ответить
    • Александр Марков > Vagant | 07.09.2007 | 15:35 Ответить
      Имеется в виду механизм образования новых генов "по Геодакяну"?
      Ответить
  • dims  | 06.09.2007 | 21:57 Ответить
    Александр, большое спасибо, очень интересно!

    Меня по этому поводу всегда интересовал один вопрос. С точки зрения информатики, мне кажется неправильным, что толерантность формируется путём отрицательной селекции, выбраковки, аутоспецифичных антител.

    Отсутствие -- не очень надёжная защита, особенно при условии, что существует механизм воспроизводства (отсутствующее всегда может быть снова создано).

    Поэтому мне кажется, что логичнее формировать толерантность не путём элиминирования аутоспецифичных клеток, а, наоборот, путём размножения таких клеток, но специальных, "тормозных". То есть, аутореактивные клетки всегда существуют, но их действие тормозится клетками памяти толерантности, которые тоже специфичны. Тогда каждая ткань организма просто должна иметь своё "представительство" в популяции тормозных клеток и никакой отрицательной селекции не нужно.

    Есть (были) ли такие такие гипотезы высказаны? Давно ли, и насколько надёжно они были отвергнуты? Насколько прослежена и подтверждена версия об элиминации?

    Спасибо.
    Ответить
    • Александр Марков > dims | 07.09.2007 | 15:51 Ответить
      "С точки зрения информатики, мне кажется неправильным, что толерантность формируется путём отрицательной селекции, выбраковки, аутоспецифичных антител. Отсутствие -- не очень надёжная защита, "

      Вполне возможно. Но в живых организмах многое устроено далеко не самым оптимальным образом. Я же говорю: "сборка чего получится из чего попало".

      "отсутствующее всегда может быть снова создано"

      Да, именно это и происходит при аутоиммунных заболеваниях (см., напр. на Элементах мои "новости" о рассеянном склерозе). Но, видимо, аутоиммунные проблемы никогда не становились таким уж важным фактором снижения жизнеспособности/плодовитости у позвоночных. Да что там позвоночные, вот все остальные животные вообще как-то обходятся без сложных систем адаптивного иммунитета, и живут ведь.

      В современном мире наша иммунная система все хуже справляется с меняющейся средой (рост аллергий и т.п.). Возможно, предлагаемая вами система универсальной защиты от аутоиммунных заболеваний нам бы сейчас очень пригодилась, но мне неизвестны факты, говорящие о существовании такой системы. Хотя, конечно, в работе иммунной системы (и позвоночных, и беспозвоночных) еще очень многое неясно. Может, что-то подобное в какой-то степени где-нибудь и есть.

      Хотя мне не совсем понятна выгода, которую будет получать организм от содержания огромного количества аутоспецифичных лимфоцитов и целой армии клеток-надсмотрщиков. Все равно ведь может в любой момент появиться новое аутореактивное антитело, для которого не найдется подходящего надсмотрщика. Это если надсмотрщики вырабатывают что-то вроде "антител к антителам". Можно, конечно, допустить, что надсмотрщики экспонируют на своей поверхности все "свои" антигены организма, и чуть какой лимфоцит к ним прилипнет, они его сразу инактивируют. Ну, хорошо, а не легче ли не парализовать его, а сразу прикончить? Где выгода от сохранения им жизни?
      Ответить
      • dims > Александр Марков | 07.09.2007 | 18:32 Ответить
        > Но в живых организмах многое устроено далеко не самым оптимальным образом.

        Да, я помню, Вы высказывали такое утверждение. Но я с ним не согласен, мне кажется, что всё должно быть оптимально. Убеждает меня в этом то, что во всех областях, в которых мы понимаем устройство (а понимаем -- это когда можем сами создать аналог), мы видим, что живое устроено оптимально. А "неоптимальным" нам оно кажется только там, до чего мы ещё сами "не доросли".

        Поэтому у меня лично постоянно возникают такие вопросы.

        > Да, именно это и происходит при аутоиммунных заболеваниях

        Так может быть, происходит совсем другое -- вымирают клоны соответствующих тормозящих клеток!?

        > Возможно, предлагаемая вами система универсальной защиты от аутоиммунных заболеваний нам бы сейчас очень пригодилась, но мне неизвестны факты, говорящие о существовании такой системы.

        Ну есть же хелперы и супрессоры. Читая, на каком пределе чувствительности как приборов, так и ума, были открыты многие свойства иммунитета, мне кажется, что учёные могли и не заметить, что они так же распределены по антиген-специфичным клонам.

        > Хотя мне не совсем понятна выгода, которую будет получать организм от содержания огромного количества аутоспецифичных лимфоцитов и целой армии клеток-надсмотрщиков.

        Почему армии? Супрессоры могут не только запрещать непосредственный иммунный ответ, но и препятствовать созреванию популяций. То есть, аутоспецифичных лимфоцитов должно быть мало. Но не потому, что они селектированы отрицательно, а потому, что они подавлены супрессорами.

        Выгода в том, что конкретная функция будет иметь конкретное материальное воплощение. Ведь это функция -- толерантность. На все прочие функции организма мы имеем ОРГАН, который ЕСТЬ. Почему же функция толерантности должна обеспечиваться ОТСУТСТВИЕМ чего-то?

        Конкретный клон отвечает за толерантность по отношению к конкретному антигену. Им можно управлять, усиливать, замедлять. Это логично. Системно. А что такое отсутствие? С него ничего не поимеешь. Прошу прощения, что так сумбурно говорю...

        > Все равно ведь может в любой момент появиться новое аутореактивное антитело, для которого не найдется подходящего надсмотрщика.

        Каким же образом? Все антигены организма будут представлены соответствующими тормозными клонами. Если возникнет антитело, специфичное к какому-то из этих антигенов, его сразу начнёт тормозить соответствующий клон супрессора. Реакция будет, но она будет подавлена.

        > Можно, конечно, допустить, что надсмотрщики экспонируют на своей поверхности все "свои" антигены организма, и чуть какой лимфоцит к ним прилипнет, они его сразу инактивируют.

        Мне кажется, это неправильно. Надсмотрщики должны экспонировать рецептор к антигену, то есть, ответную часть, ту же самую, что и агрессивные клетки. Просто в ответ на антиген они должны осуществлять торможение системы, а не возбуждение.

        Ведь что-такое иммунитет? Это какая-то антигенспецифичная система реагирования. В первооснове своей она должна быть основана на тех же принципах возбуждения и торможения, как и всё живое. Только каналы должны быть антигенспецифичными.

        > Ну, хорошо, а не легче ли не парализовать его, а сразу прикончить?

        Ну приканчивание -- это просто крайний случай подавления. Может быть, и легче. Но, на мой взгляд, важно не то, что сделать, а какой механизм это осуществляет и есть ли ЯВНОЕ представительство механизма в каком-то соматическом образовании.

        Наверное, отрицательная селекция есть, я не смею этого отвергать. Единственное, что мне кажется, должно быть вдобавок -- это явное воплощение того селекционера, который селекцию произвёл.
        Ответить
Написать комментарий

Другие новости


Элементы

© 2005-2017 «Элементы»