Искусственный белок поможет победить ВИЧ

Белок сайт-специфичная рекомбиназа (цветная, внизу) прикрепился к двойной спирали ДНК (белая, вверху). Изображение с сайта www.nature.com
Белок сайт-специфичная рекомбиназа (цветная, внизу) прикрепился к двойной спирали ДНК (белая, вверху). Изображение с сайта www.nature.com

Имеющиеся на сегодняшний день методы лечения ВИЧ мешают вирусу внедряться в геном хозяина, но если внедрение всё же произошло, клетка становится неизлечимой. Методом «искусственной эволюции» германские ученые создали белок, способный удалять из генома зараженных клеток наследственный материал вируса. К сожалению, пока неясно, как доставить спасительный белок в зараженные клетки.

Сегодня уже существует ряд методов лечения вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), которые позволяют перевести заболевание в хроническую форму и продлить жизнь зараженных людей. Имеющиеся препараты направлены против разных стадий жизненного цикла вируса — одни из них блокируют механизм проникновения вируса в клетку, другие выводят из строя вирусную обратную транскриптазу — фермент, при помощи которого вирус переписывает свою наследственную информацию в геном хозяйской клетки. Все эти методы, однако, не позволяют вылечить те клетки, в геном которых вирус уже успел переписаться. Пока в геноме зараженной клетки присутствует провирус (так называется копия вирусного генома, встроенная в хозяйский геном), вирус будет постоянно воскресать.

Германские ученые при помощи метода искусственной эволюции получили фермент, способный находить провирус ВИЧ в геноме клетки и вырезать его оттуда. За основу был взят белок Cre (cyclic recombinase), относящийся к классу так называемых сайт-специфичных рекомбиназ (site-specific recombinase). Этот белок, широко применяемый биологами для различных манипуляций с ДНК, изначально был выделен из вируса-бактериофага P1. Белок Cre узнаёт две расположенные на некотором расстоянии друг от друга последовательности из 34 нуклеотидов и вырезает участок ДНК, расположенный между ними. Последовательность, распознаваемая белком Cre, получила название LoxP (locus of X-over P1)

У провируса ВИЧ на концах имеются особые последовательности-палиндромы, или обращенные повторы (так называемые long terminal repeats, LTR) — это характерная черта многих вирусов и мобильных генетических элементов, таких как транспозоны и ретротранспозоны. Ученые решили искусственно вывести такую разновидность белка Cre, которая вместо «родной» последовательности LoxP узнавала бы какой-то участок концевых повторов провируса ВИЧ.

Сначала в концевых повторах ВИЧ был найден участок, наиболее сходный с LoxP. Его назвали LoxLTR. Сходство оказалось довольно низким: совпадало лишь 17 нуклеотидов из 34. Исходный белок Cre наотрез отказался «признавать» эту последовательность. Не помогло и внесение в белок разнообразных небольших изменений (мутаций). Стало ясно, что для создания необходимого фермента в белок Cre должен быть внесен целый комплекс изменений, который невозможно угадать методом проб и ошибок — слишком много вариантов пришлось бы перебрать.

Тогда ученые решили расчленить задачу, оказавшуюся слишком сложной, на составные части, и решать их по отдельности. Для этого было изготовлено и внедрено в геном подопытного объекта (кишечной палочки) несколько модифицированных вариантов LoxLTR, более похожих на LoxP, чем исходная версия. «Задача» в данном случае — это 17 нуклеотидов, отличающих LoxLTR от LoxP, а «расчленение задачи» состояло в том, что каждый из модифицированных вариантов LoxLTR содержал лишь некоторые из этих 17 отличий, а в остальном был идентичен LoxP.

Теперь дело пошло лучше: для каждого из модифицированных вариантов LoxLTR удалось подобрать такие модификации Cre, которые хоть и с трудом, но всё же узнавали их. Так из различных вариантов белка Cre были отобраны «перспективные кандидаты». В них снова раз за разом вносили небольшие случайные изменения и проводили отбор на способность распознавать данную последовательность нуклеотидов. В результате были получены белки, уверенно и безошибочно распознающие тестируемые последовательности нуклеотидов (модифицированные LoxLTR) и вырезающие куски ДНК, расположенные между ними.

Последовательность LoxP, которую распознает исходный белок Cre, и наиболее похожий на нее участок в геноме ВИЧ (LoxLTR). Ниже показаны различные модификации последовательности LoxLTR, использованные в экспериментах по искусственной эволюции. Можно заметить, что последовательность LoxP, не считая центральных 8 нуклеотидов, представляет собой палиндром — левая часть комплементарна правой, прочтенной в обратном порядке. К таким последовательностям ДНК-связывающие белки (например, сайт-специфичные рекомбиназы) обычно прикрепляются по два, в виде димеров, как показано на рисунке. Последовательность LoxLTR не является палиндромом, что создало исследователям дополнительные трудности. Рис. из обсуждаемой статьи в Science
Последовательность LoxP, которую распознает исходный белок Cre, и наиболее похожий на нее участок в геноме ВИЧ (LoxLTR). Ниже показаны различные модификации последовательности LoxLTR, использованные в экспериментах по искусственной эволюции. Можно заметить, что последовательность LoxP, не считая центральных 8 нуклеотидов, представляет собой палиндром — левая часть комплементарна правой, прочтенной в обратном порядке. К таким последовательностям ДНК-связывающие белки (например, сайт-специфичные рекомбиназы) обычно прикрепляются по два, в виде димеров, как показано на рисунке. Последовательность LoxLTR не является палиндромом, что создало исследователям дополнительные трудности. Рис. из обсуждаемой статьи в Science

Ни один из этих белков, однако, еще не мог распознать реальную последовательность LoxLTR — ту, которая присутствует в геноме ВИЧ. Каждый из них научился узнавать лишь отдельные признаки этой последовательности. Это произошло благодаря тому, что в каждом белке зафиксировались определенные полезные мутации — в каждом случае разные. Теперь нужно было объединить их все в одной белковой молекуле. Для этого ученые стали комбинировать фрагменты отобранных белков, и среди получившихся вариантов нашлись такие, которые с низкой эффективностью могли вырезать провирус ВИЧ из генома. Еще несколько циклов искусственной эволюции — и в распоряжении исследователей оказался новый белок, отлично справляющийся с поставленной задачей. Он получил название Tre. Новый фермент, как выяснилось, сильно отличается от своего прототипа — белка Cre. Замене подверглись целых 19 аминокислот.

Белок Tre протестировали не только на кишечной палочке, но и в культуре клеток человека, геном которых содержал провирус ВИЧ со встроенным геном светящегося белка. Свечение этих клеток сигнализировало о присутствии активного провируса. Когда в эти клетки был внедрен ген, кодирующий белок Tre, две трети клеток перестали светиться. Последующий анализ генома клеток подтвердил, что провирус был оттуда вырезан. Никаких вредных побочных эффектов выявлено не было.

Авторы признают, что их открытие едва ли будет использовано в медицинской практике в ближайшие годы. Непонятно, как доставить белок Tre в зараженные клетки и как при этом избежать побочных последствий, которые обязательно появятся на уровне целого организма — хотя их и не было на уровне отдельных клеток. Важность данной работы в том, что она открывает принципиально новый путь, новую стратегию в борьбе с ВИЧ.

Источник: Indrani Sarkar, Ilona Hauber, Joachim Hauber, Frank Buchholz. HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase // Science. 2007. V. 316. P. 1912–1915.

См. также:
Древняя вирусная инфекция сделала людей беззащитными перед ВИЧ, «Элементы», 27.06.2007.

Александр Марков


8
Показать комментарии (8)
Свернуть комментарии (8)

  • PavelS  | 07.07.2007 | 05:52 Ответить
    Возможно решается не совсем нужная задача. Можно не лечить больные клетки. Их вполне достаточно убивать...
    Ответить
    • zg > PavelS | 09.07.2007 | 10:33 Ответить
      исключительно хирургическим путём или точечными ядерными ударами.

      Зачем убивать если можно вылечить?
      Ответить
      • PavelS > zg | 09.07.2007 | 22:50 Ответить
        Затем что это МОЖНО и этого ДОСТАТОЧНО. При этом гибель небольшой части клеток от лечения не смертельно. Касательно "можно вылечить" - то эта вакцина будет ещё лет 20 доводиться до ума, и возможно что на практике окажется что вылечить и нельзя, а убить будет проще.
        Ответить
        • zg > PavelS | 10.07.2007 | 08:05 Ответить
          если мыслить глобально, то вообще нужно ли лекарство от ВИЧ? "что вылечить и нельзя, а убить будет проще"
          Ответить
          • PavelS > zg | 12.07.2007 | 20:04 Ответить
            Убить всех инфецированных людей будет сложно, т.к. это вызовет "недовольство", так что они попрячутся, займутся самолечением и т.д. А вот от клеток организм разрешение спрашивать не будет - можно лечить и негуманным убийством.
            Ответить
      • TestPilot > zg | 29.07.2007 | 02:10 Ответить
        Целиком согласен с Павлом - запускать инициацию механизма клеточной смерти при нахождении HIV ДНК было бы эффективнее. Ведь в предложенном варианте вырезанная часть вирусного генома остается плавать внутри клетки - и не факт, что эта ДНК не будет обратно перезаписана.

        Плюс, это позволило бы в отдаленной перспективе создавать персональные раковые терапии - там исключением одной мутации из клеточного генома будет недостаточно для создания ракового иммунитета - клетка останется предрасположенной к другим раковым мутациям. Да и "лишние" бывшие раковые клетки, пусть и в излеченной форме организму не нужны.
        "Убийство" же отдельных зараженных/мутировавших клеток ничего плохого организму в целом не несет.

        P.S. А вообще - очень впечатляющее достижение!
        Ответить
    • AD > PavelS | 13.07.2007 | 13:44 Ответить
      Не факт, что убить зараженные клетки проще, чем удалить материал вируса.
      Ответить
    • legat_toy > PavelS | 27.09.2007 | 15:17 Ответить
      Убивать зараженные клетки это хорошо. А если этих клеток больше здоровых или подавляющее большинство? Давайте убивать организм целиком :)
      Ответить
Написать комментарий

Другие новости


Элементы

© 2005-2017 «Элементы»