Светлана Ястребова
«Химия и жизнь» №2, 2016

Оптогенетика. Как управлять нейроном с помощью света («Химия и жизнь» №2, 2016)

Оптогенетика — метод исследования возбудимых клеток, использующий белки, которые встраиваются в мембрану клетки и активируются светом (отсюда «опто»). Такие белки (опсины) есть у большинства животных в сетчатке глаз, а также у некоторых растений, например у зеленых водорослей. Чтобы встроить фотоактивируемые протеины в мембраны нейронов, приходится привносить в нейроны гены родопсинов, полученные из других организмов, отсюда «генетика». В 2015 году оптогенетика отметила свой десятилетний юбилей. За это время эффективный инструмент изучения нервной системы окреп и получил ряд применений, которые изначально были недоступны.

Мозг и его элементы

Сознание, личность, интеллект — все это создается нейронами. А значит, если мы хотим изучать эти аспекты человеческого (и не только) существа, обязательно надо понимать, что происходит с нервными клетками объекта исследования. Главная проблема в том, что этих нервных клеток чересчур много и уследить сразу за всеми нейронами невозможно. К тому же нервные клетки имеют тенденцию образовывать скопления, поэтому отделить действие одного нейрона от другого, да и воздействовать на каждую клетку по отдельности в большинстве случаев проблематично. Отсюда есть два выхода: смириться и регистрировать активность групп клеток, получая некую «среднюю температуру по больнице», либо все-таки пытаться исследовать один нейрон, по возможности — очень нужный и важный для организма. Первое чаще применяют при исследованиях мозга млекопитающих, второе — на простых нервных системах (например, отслеживают электрическую активность крупных «командных нейронов» оборонительного поведения виноградной улитки или похожих по свойствам клеток морского брюхоногого моллюска аплизии). Моллюски, черви и дрозофилы с их сравнительно небольшими нервными системами — это, конечно, хорошо, но от человека они весьма далеки. Хочется исследовать кого-то, чей мозг по строению ближе к нашему, и поэтому чаще выбирают первый подход.

Методов исследования нервной системы много, но они почти всегда не очень точны. Есть функциональная магнитнорезонансная томография, которая не дает видеть отдельные клетки и распознает только сравнительно медленные процессы (изменение кровенаполнения мозговых сосудов). Есть электроэнцефалография, она побыстрее, но индивидуальные нейроны тоже не различает и подобна попыткам записать что-то разборчивое, подвесив микрофон над футбольным полем в разгар матча. Наконец, можно применять флуоресцентные красители, меняющие цвет в ответ на изменение концентраций определенных ионов в клетке или на их суммарный заряд (то есть на мембранный потенциал нейрона). Такие красители действуют довольно медленно. Их временное разрешение (время отклика) недостаточно велико, чтобы обнаружить и «показать» отдельный потенциал действия в нейроне. Точнее, так считалось до недавней публикации, авторы которой все же смогли это сделать (Science, 2015, 350, 6266: 1361–1366, doi: 10.1126/science.aab0810).

Словом, регистрировать активность одной-единственной клетки, не затрагивая соседние нейроны, не так-то просто. Еще сложнее специально изменять эту активность. Можно вводить в мозг фармакологические препараты, действующие только на клетки с определенными свойствами, потом посмотреть на эти клетки под микроскопом или сделать срез части мозга животного и регистрировать его электрическую активность микроэлектродами. Но чтобы получить подобный препарат, зверька надо убить. Даже если отбросить жалость к животным и соображения гуманности, надо признать, что такие эксперименты крайне расточительны. Для того чтобы узнать, как поменялись сигналы небольшого числа клеток, нужно вырастить целый мозг, кормить его и ухаживать за ним, а после подготовки препарата его можно будет использовать час-полтора, редко дольше.

Другой вариант — стимулировать отдельные нейроны электрическими сигналами искусственного происхождения, приводя эти сигналы по соответствующему нерву, или поливать клетки нейромедиаторами в рамках модели искусственного синапса. Но для этого сначала нужно отыскать подходящие клетки, а это задача нетривиальная.

Наконец, существует метод искусственного высвобождения глутамата из синаптических везикул под действием ультрафиолета (этот метод еще называют glutamate uncaging). По сути, свет в данном случае имитирует действие возбуждающего сигнала, пришедшего на клетку, запуская выброс нейромедиатора в синапсе. Это весьма точное и действенное средство, но и у него есть недостаток. Действием ультрафиолета сейчас умеют высвобождать только глутамат, однако далеко не все нейроны выделяют именно его, а не какой-нибудь другой переносчик сигнала. Помимо всего прочего, искусственное высвобождение глутамата не так сильно активирует нейрон-мишень, как электрическая стимуляция по нерву, и заставить клетку выдавать потенциалы действия в данном случае проблематично.

Из водоросли в нейрон

С 2005 года тонкое манипулирование нейронной активностью стало возможным, и в этом помогли фотоактивируемые вещества, способные улавливать кванты света и реагировать на них. Некоторые из них были известны давно, с начала 1970-х, но применять в нейробиологических исследованиях их научились только в середине 2000-х.

У одноклеточной водоросли Chlamydomonas reinhardtii есть белок ченнелродопсин-2 (ChR2). Из названия понятно, что это родственник родопсина палочек сетчатки. Как и глазной пигмент, ченнелродопсин реагирует на облучение светом, только немного по-другому: он усиливает приток положительных ионов в клетку водоросли. Это влияет на ее мембранный потенциал (потенциал покоя): он в течение тысячных долей секунды от заведомо отрицательного приближается к нулю; специалисты говорят: «клетка деполяризуется». Потенциалов действия клетка хламидомонады при этом не генерирует, но это было бы теоретически возможно: электрические сигналы, подобные потенциалам действия, могут возникать и в растительных клетках (Plant, Cell and Environment, 2007, 30, 249–257, doi: 10.1111/j.1365-3040.2006.01614.x).

Когда ген ченнелродопсина-2 выделили из хламидомонады и клонировали, его последовательность нуклеотидов стала известна нескольким исследовательским коллективам, среди которых была лаборатория Карла Дайссерота (Karl Deisseroth) в Стэнфордском университете. Это событие оказалось решающим для рождения оптогенетики. В то время как другие коллективы стали активно изучать многообразие ченнелродопсинов, руководитель этой лаборатории, нейрофизиолог и по совместительству психиатр (вероятно, практическое мышление Дайссерота-врача сыграло не последнюю роль в выборе объекта изучения), заметил в ChR2 кое-что достойное прикладного использования. Раз у нас есть белок, способный изменять мембранный потенциал клетки, и есть его ген, то почему бы этот ген не внедрить в электрически возбудимую клетку и не посмотреть, что из этого выйдет?

Сказано — сделано. Ген ченнелродопсина-2 прикрепили к промотору (последовательности ДНК, которая указывает РНК-полимеразе, что следующий за ней участок молекулы нужно считать и сделать по его образцу мРНК), вложили в вирус, а сам вирус тонкой иглой ввели в мозг мыши. Только надо еще проверить, куда именно попали вирусные частицы, не промахнулись ли мы с местом инъекции. Чтобы понять это, помимо гена светочувствительного белка нужно ввести в нейрон ген вещества-репортера — это вещество будет указывать на присутствие ченнелродопсина. Удобный репортер — флуоресцентный белок, ведь флуоресценция в клетках видна и на срезах мозга, и — при достаточной концентрации — даже снаружи тела. Ген ChR2 и ген репортера (например, желтого флуоресцентного белка YFP) находятся под одним промотором, поэтому экспрессируются они вместе, и оба белка образуются в клетке одновременно. Если ченнелродопсин в клетке есть — она флуоресцирует.

Справедливости ради надо отметить, что коллектив Дайссерота не первым привнес ченнелродопсин в клетки животных. Настоящий пионер в этой области — Георг Нагель (Georg Nagel), о чем он сам напоминает в статье, посвященной десятилетию метода оптогенетики (Nature Neuroscience, 2015, 18, 1202–1212, doi: 10.1038/ nn.4106). Именно он показал принципиальную возможность применения ChR2 у амфибий и млекопитающих в работе 2003 года (Proceedings of the National Academy of Sciences, 2003, 100, 13940–13945), где ген ченнелродопсина экспрессировался в яйцеклетках лягушки ксенопуса и в клетках культуры HEK293 (human embryonic kidney — почка зародыша человека). Белок ChR2 в этих объектах прекрасно активировался синим светом, микроэлектроды при этом регистрировали ток положительно заряженных частиц через мембрану. Кроме того, именно Нагель предоставил Дайссероту материал для трансфекции нейронов геном ченнелродопсина.
Кристаллическая структура ченнелродопсина (изображение: en.wikipedia.org) («Химия и жизнь» №2, 2016)

Почти все готово, осталось только встроить в мозг источник света, который будет активировать клетки, несущие ченнелродопсин. Таким источником обычно служит миниатюрный светодиод на оптоволокне, дающий свет с длиной волны около 480 нм (синий). Именно на такое излучение ChR2 реагирует наиболее продуктивно. Волокно вводят в желаемый участок головного мозга и закрепляют с помощью специальной канюли на поверхности черепа (рис. 1). Животное может носить такой прибор очень долго, и, чтобы записать активность его клеток, не нужно его убивать. А это хорошо и с точки зрения этики, и с точки зрения практики. Подопытное существо во время оптогенетического эксперимента может беспрепятственно передвигаться, и его поведение при этом будет заведомо ближе к натуральному, чем если те же самые нейроны изучать в составе срезов мозга или у животного, зафиксированного в стереотаксисе под наркозом.

Рис. 1. Общая схема введения фотоактивируемого канала в нейроны («Химия и жизнь» №2, 2016)

Рис. 1. Общая схема введения фотоактивируемого канала в нейроны

Одного только источника света недостаточно, чтобы провести полноценный эксперимент. Мы не можем сказать, как «подопытные» нейроны отреагировали на фотостимуляцию, пока не подтвердим появление электрических сигналов в ответ на воздействие светом. Стало быть, параллельно с инструментом для активации нейрона нужно средство для записи его активности, так что в комплекте с источником света в мозг вживляют микроэлектроды. Собственно, используя эти микроэлектроды, Дайссерот и коллеги подтвердили на практике, что с помощью ченнелродопсина можно изменять мембранный потенциал клетки сильно и быстро, вплоть до генерации потенциалов действия, и описали результаты в статье (Nature Neuroscience, 2005, 8, 1263–1268, doi: 10.1038/nn1525). С этой работы началась эра оптогенетики.

Включатели, выключатели и другие

Ченнелродопсин — не единственный фотоактивируемый канал на службе у оптогенетики. Есть еще галородопсин (HR, рис. 2) — белок архей, который при активации желтым светом впускает в клетку отрицательно заряженные ионы хлора (а не положительные натрия и калия, как в случае ченнелродопсина). Это приводит к гиперполяризации клеточной мембраны: разность потенциалов на ней становится более отрицательной, чем в покое, и клетка, которая раньше легко выдавала потенциалы действия, при активации галородопсина «замолкает».

Рис. 2. Схема работы галородопсина («Химия и жизнь» №2, 2016)

Рис. 2. Схема работы галородопсина. Пока этот канал активен, клетке труднее генерировать потенциалы действия

Гены галородопсина и ченнелродопсина можно ввести в одну и ту же клетку, а можно в разные. Два фотоактивируемых канала с различными свойствами лучше, чем один. Но и это еще не все (рис. 3). Существуют также бактериородопсин (BR) и протородопсин (PR). Как и ченнелродопсин, при активации они открывают путь для положительно заряженных ионов, но не для всяких, а только для ионов водорода — протонов. А эффект получается противоположный ченнелродопсину: протоны не входят в клетку, а уходят из нее, за счет чего мембрана гиперполяризуется и способность клетки к возбуждению теряется.

Рис. 3. Разновидности фотоактивируемых каналов, используемых в оптогенетике (изображение: neurowiki2013.wikidot.com) («Химия и жизнь» №2, 2016)

Рис. 3. Разновидности фотоактивируемых каналов, используемых в оптогенетике

Есть еще экзотические опсины животных под общим названием Opto-XR. Это не ионные каналы, а гибриды родопсина колбочек сетчатки млекопитающих и некоторых рецепторов, сопряженных с G-белками (G-белки используют превращение нуклеотида ГДФ в ГТФ и запускают множество сигнальных процессов в клетках). В частности, ряд Opto-XR несет фрагменты адренорецепторов, а одна необычная разновидность состоит из части родопсина крысы и части рецептора к серотонину типа 1A. Конечно, не будучи каналами, Opto-XR не могут обеспечить потенциал действия, зато их активация имитирует активацию рецепторов, части которых они в себе несут. Иначе говоря, после «засветки» Rh-CT(5-HT1A) клетка будет функционировать так, как будто на ее синапсы пришел серотонин. Показано, что такие белки-гибриды располагаются на мембранах нейронов примерно там же, где и настоящие рецепторы к аналогичным нейромедиаторам. Поэтому с их помощью можно изучать различные системы передачи сигналов в мозге, не опасаясь получить далекие от действительности результаты.

Совсем недавно исследователи из Медицинской школы Техасского университета описали целое семейство новых родопсинов водорослей, которые проводят отрицательно заряженные ионы внутрь клетки. Они реагируют на фотостимуляцию быстрее, чем родопсины, уже применяемые в оптогенетике, и требуют меньше света для активации (Science, 2015, 349, 6248, 647–650, doi: 10.1126/science. aaa7484). Возможно, у них большое будущее.

Оптогенетика и поведение

Но довольно нейрофизиологической теории, пора переходить к практике. Поведение зависит от последовательностей нейронных сигналов, появившихся в нужное время в нужном месте. Получается, что, зная время, место и последовательность этих сигналов, мы можем воссоздать нужную нам форму поведения и получить недостающую информацию о том, за счет каких структур это поведение проявляется.

Занятное исследование на эту тему недавно было опубликовано в Nature (2015, 519, 233–236, doi: 10.1038/ nature14024). Хотя оптогенетические методики изначально тестировали на грызунах, ничто не запрещает делать то же самое на других модельных объектах — например, на дрозофилах. Конечно, для этого придется немного модифицировать технику, ведь нейрофизиология насекомых отличается от нейрофизиологии млекопитающих.

На дрозофил, как и на людей, действует долгое пребывание в тесных скоплениях себе подобных, проще говоря — в толпе. Другими словами, они тоже подвержены стадному чувству. Известно, что углекислый газ для дрозофил имеет запах, притом весьма неприятный. Одинокая муха, почуяв CO2, неспешно улетает туда, где воздух свежее. Если это насекомое находилось в стайке, за ним быстро ретируются и другие. Даже если среди ста мух запах чувствует только половина, а у остальных обоняние заблокировано, вся сотня двинется подальше от источника вони. Такая синхронность, как ни странно, достигается вовсе не с помощью обоняния. Реакция избегания в данном случае носит коллективный характер: одни мухи передают другим сигналы о необходимости уйти подальше от источника углекислого газа. Призыв к бегству насекомые передают, трогая друг друга. При этом у мух, получающих сигнал, активируются механосенсорные нейроны на кончиках лапок. Чтобы доказать это, применили несколько методов, в числе которых была и оптогенетика. В частности, в одном из экспериментов мухам, находящимся в атмосфере с нормальным (не избыточным для них) содержанием СО2, оптогенетически активировали механосенсорные нейроны кончиков лапок со встроенными в клетки ChR2, и насекомые демонстрировали реакцию избегания, как если бы рядом с ними сильно пахло углекислым газом.

Кроме всего прочего, с помощью фотоактивации можно внедрить в нейроны информацию, которую они не получали в реальности. Проще говоря, оптогенетика позволяет создавать ложные воспоминания. Это на примере мышей доказал коллектив Сусуму Тонегава из Массачусетского технологического университета в 2013 году (Science, 2013, 341, 6144, 387–391, doi: 10.1126/science.1239073). Исследователи внедрили ченнелродопсин-2 в нейроны двух регионов гиппокампа, отвечающих за перевод информации из кратковременной памяти в долговременную, — зубчатую извилину и поле CA1. Ченнелродопсином пометили только те клетки, которые в предварительных экспериментах с записью электрической активности возбуждались, если животное пугали звуком и ударом электрическим током в определенных «декорациях» (еще говорят — в определенном контексте). То есть изначально животное запоминало, что бояться звука в одной обстановке стоит, а в другой — не обязательно. После этого нейроны с ченнелродопсином специально активировали, когда животное находилось в других «декорациях» и, по идее, не должно было демонстрировать страх. Однако во время этой процедуры мыши, находившиеся в новой обстановке (где их никогда не били током), замирали на месте, прятались в угол или пищали.

Раз уж получилось внедрить в голову то, что животное никогда не запоминало, то вернуть утраченную информацию точно можно. Это и сделали сотрудники той же лаборатории двумя годами позже (Science, 2015, 348, 6238, 1007–1013, doi: 10.1126/science.aaa5542). Сначала они научили грызунов определенному навыку, затем ввели им в мозг ингибиторы синтеза белка, которые мешают вспомнить недавно изученное (это доказали во множестве более ранних работ). Тем не менее, забытое воспоминание можно было вернуть, если оптогенетически активировать определенные клетки гиппокампа. Какие именно нейроны нужно задействовать, выясняли примерно так же, как и в предыдущей работе.

Оптогенетика и сон

Оптогенетика помогла и в изучении сна. Было известно, что в боковых областях гипоталамуса есть нейроны, выделяющие вещество орексин, он же гипокретин. Стабильное бодрствование невозможно при пониженном содержании гипокретина в гипоталамусе. Если клетки, выделяющие его, недостаточно активны, у животного (и у человека тоже) развивается нарколепсия — во время бодрствования случаются внезапные приступы сна. Больной либо совсем засыпает, либо у него проявляются некие отдельные признаки сна, например резкое падение тонуса мышц или выпадение из сознания. Приступы нарколепсии невозможно контролировать, и они могут случиться в самый неподходящий момент — скажем, когда человек за рулем.

Но это могло быть и совпадением, и без дополнительных экспериментов нельзя было утверждать, что именно орексиновые нейроны поддерживают бодрствование. Нужно было проверить, что происходит со сном во время их активации. Сотрудники лаборатории Карла Дайссерота встроили в гипокретиновые нейроны гипоталамуса мышей ченнелродопсин-2, после чего периодически стимулировали мозг грызунов светом, пока те спали (Nature, 2007, 450, 420–424, doi: 10.1038/nature06310). Мыши от такого воздействия пробуждались как на стадии медленноволнового сна, так и на стадии быстроволнового. При этом орексиновые нейроны активировались с разной силой в зависимости от того, как часто на них светили. Все это в совокупности дает право утверждать, что выделение орексина (гипокретина) в достаточном количестве действительно обеспечивает поддержание бодрствования.

Оптогенетика и сердце

Метод оптогенетики необязательно применять только к нейронам, он подходит для всех клеток, способных возбуждаться под действием электрических сигналов. Кроме нейронов, у животных это клетки мышц, в том числе — сердечной мышцы. Кардиомиоциты должны возбуждаться синхронно, это обеспечивает их одновременное сокращение. Эксперименты с оптогенетической активацией клеток сердца крысят, людей и собак показали, что волны возбуждения и сокращения, вызванные стимуляцией синим светом, не отличаются по своим параметрам от «настоящих», электрических волн (Circulation. Arrhythmia and electrophysiology, 2011, 4, 5, 753–760, doi: 10.1161/CIRCEP.111.964247, Heart Rhythm, 2012, 9, 11, 1910). Эти работы проводили не на живых объектах, тем не менее результаты показывают, что активность больного сердца теоретически можно будет подправить с помощью оптогенетики.

Оптогенетика и психиатрия

Вероятно, не будет преувеличением сказать, что применение метода оптогенетики в психиатрии — одна из главных конечных целей Дайссерота, учитывая его вторую профессию. Было бы замечательно сначала узнать, как нейроны головного мозга связаны друг с другом, а затем стимулировать (или при необходимости подавлять) передачу сигналов между нужными группами клеток. Задача крайне трудоемкая, но теоретически выполнимая. Разработчики метода оптогенетики сделали в этой области несколько открытий. Некоторые из них касаются клеток, выделяющих дофамин. Этот нейромедиатор, помимо всего прочего, играет огромную роль в поддержании хорошего настроения и дает ощущение вознаграждения за сделанное (говорят, что нейроны, выделяющие дофамин, входят в систему вознаграждения). Наркотики, такие, как кокаин, имитируют действие дофамина на нейроны, вызывая ощущение удовлетворенности. Организм запоминает это ощущение и привыкает к наркотику, образуется психологическая и физиологическая зависимость.

В состав системы вознаграждения мозга входит прилежащее ядро. Если его клетки, выделяющие дофамин, снабдить галородопсином, а потом стимулировать их светом, прилежащее ядро «выключается», а вместе с этим временно пропадает заранее развитая тяга подопытных крыс к кокаину (Nature, 2014, 505, 309–317, doi: 10.1038/nature12982). Можно было бы проделать похожие манипуляции и на людях-наркоманах, но для этого придется изменять геном их нейронов, что пока не разрешается делать.

Достаточное количество дофамина защищает от некоторых форм депрессии, а также от болезни Паркинсона. И если вклад оптогенетики в исследования паркинсонизма пока не очень велик, то депрессивное поведение грызунов небезуспешно пытались устранить с помощью фотоактивируемых каналов (Nature, 2013, 493, 7433, 537–541, doi: 10.1038/nature11740).


Итак, в теории оптогенетика может пролить свет на любые патологические состояния, связанные с возбудимыми клетками. Это не только наркомания и нарколепсия, депрессия и болезнь Паркинсона, но и шизофрения, инфаркты, тревожность, стрессовые расстройства и многое другое. Пока что возможность лечения этих состояний с помощью фотоактивируемых каналов — вопрос технологии и морали. Однако возможно, что лет через 20–30 потенциал оптогенетики будет ограничен только этическими устоями ученых и чиновников, контролирующих научные исследования.


0
Написать комментарий

    Элементы

    © 2005-2017 «Элементы»